熒光定量PCR儀選擇誤區(qū)及注意要點(diǎn)

熒光定量PCR 因操作方便、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，受到越來越多的分子生物學(xué)研究者青睞。面對(duì)各種不同性能的產(chǎn)品，您又該如何選擇呢？

首先建議大家走出認(rèn)識(shí)熒光定量PCR的兩個(gè)誤區(qū)：

誤區(qū)一：儀器通道越多越好

隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，多重?cái)U(kuò)增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從zui初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。

在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來，真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的，有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購(gòu)買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。

考慮多重?zé)晒舛?span lang="EN-US">PCR的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。

誤區(qū)二：real-time PCR儀無需梯度功能

對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度（Tm值），但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果，退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。

不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要，因?yàn)?span lang="EN-US">Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過程，簡(jiǎn)化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn)，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

當(dāng)我們走出誤區(qū)，想要選擇一款自己需求的熒光定量PCR儀時(shí)我們又該關(guān)注些什么呢？

1、儀器的檢測(cè)通量

在購(gòu)買定量PCR儀的時(shí)候要根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測(cè)通量小到16個(gè)多到384個(gè)。如果進(jìn)行一般的基因表達(dá)研究或病原體檢測(cè)，實(shí)在不必購(gòu)買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用；需要尋找要新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室可以考慮購(gòu)買384孔板的儀器。假如經(jīng)費(fèi)有限無法購(gòu)買384孔板儀器的實(shí)驗(yàn)室，可以考慮購(gòu)買運(yùn)行速度快（帶有FAST模塊）的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實(shí)驗(yàn)速度和結(jié)果的頸瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算純化系統(tǒng)可配合Roche的Lightcycyler熒光定量PCR儀使用。Eppendorf 的ep Motion5070、5075全自動(dòng)工作站，即可解決核酸純化問題，又可進(jìn)行96孔板、384孔板的PCR反應(yīng)體系構(gòu)建，不用加樣加到眼發(fā)黑、手抽筋。

2、硬件設(shè)計(jì)特點(diǎn)

熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式、創(chuàng)新的離心式等，每種設(shè)計(jì)都有它的獨(dú)到之處但也都有無法避免的缺憾。

傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測(cè)，這些光學(xué)結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源和檢測(cè)器的光程各不相同——邊緣效應(yīng)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常會(huì)使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye作為參照校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實(shí)驗(yàn)過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。CCDzui大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號(hào)，但是靈敏度較低，而且同時(shí)檢測(cè)樣品間的熒光信號(hào)存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。

創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測(cè)，離心式的設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng)。LED光源是冷光源對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響，因此無需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長(zhǎng)無需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個(gè)熒光信號(hào)，但是檢測(cè)靈敏度高。但這類儀器運(yùn)行速度非?？欤泊嬖跇颖玖啃?、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均為這一類儀器。

隨著熒光定量PCR技術(shù)的使用，聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統(tǒng)的96孔板儀器上大作改進(jìn)。首先是Stratagene的Mx3000p在檢測(cè)上突破了使用CCD改用PMT檢測(cè)熒光信號(hào)，大大提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，但激發(fā)光源仍然沿用傳統(tǒng)的鹵鎢燈并且沒有梯度功能。Eppendorf 公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀，使用了96個(gè)LED為激發(fā)光源，采用先進(jìn)的CPM（第二代PMT）及96合一光纖為檢測(cè)系統(tǒng)，不但避免了邊緣效應(yīng)還保證所有樣品間的熒光信號(hào)沒有干擾。

3、運(yùn)行速度

在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間，提高PCR的特異性。為了更好的完成實(shí)驗(yàn)，各個(gè)廠家紛紛推出能快速運(yùn)行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動(dòng)力學(xué)原理，可在半小時(shí)左右完成30-40個(gè)循環(huán)。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個(gè)循環(huán)。zui近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S 和2S的銀質(zhì)模塊熒光定量PCR儀 ，升降溫的速度可達(dá)到6℃/秒和4.5/秒，是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度zui快的熒光定量PCR 儀。一個(gè)在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應(yīng)，eppendorf Mastercycler ep realplex4S 和2S （銀質(zhì)模塊）只需運(yùn)行28分鐘——別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運(yùn)行好幾輪了。

4、靈活性

大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備固然讓人羨慕，但是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的儀器供應(yīng)商擁有眾多技術(shù)專家，有的還能提供整個(gè)分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究平臺(tái)，不但了解、滿足您現(xiàn)在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級(jí)和更換模塊。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級(jí)為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變?yōu)?span lang="EN-US">384孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A 就可以根據(jù)您研究的需要升級(jí)成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全，如實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級(jí)為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀，而且可升級(jí)的型號(hào)有4種：2通道銀質(zhì)、鋁制模塊和4通道銀質(zhì)、鋁制模塊。您可以根據(jù)自己的經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買、升級(jí)任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

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